RNA修飾在生命過(guò)程和疾病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到重視，其中5-甲基胞嘧啶(m5C)修飾是熱門(mén)研究領(lǐng)域。本文聚焦于m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2在肝癌中的作用，NSUN2通過(guò)M5C修飾穩(wěn)定PKM2 mRNA促進(jìn)肝癌糖酵解和進(jìn)展。
 

　　m5C修飾是指在RNA分子中，通過(guò)特定的酶將胞嘧啶(C)的第5位碳原子上加上一個(gè)甲基基團(tuán)，形成5-甲基胞嘧啶。這種修飾不會(huì)改變RNA的基本核苷酸序列，但會(huì)在不改變遺傳信息編碼的基礎(chǔ)上，賦予RNA新的化學(xué)和生物學(xué)特性。m5C修飾主要由NSUN(NOL1/NOP2/SUN)家族的甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成，涉及mRNA穩(wěn)定性與翻譯調(diào)控、tRNA 穩(wěn)定性與解碼功能、rRNA加工與核糖體功能和非編碼RNA功能調(diào)節(jié)，廣泛地參與到各種生命活動(dòng)的調(diào)控中。
 

　　研究背景：
 

　　肝癌(HCC)是常見(jiàn)癌癥及癌癥死亡主要原因，術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)致患者5年生存率低。RNA 的5-甲基胞嘧啶(m5C)修飾在多種癌癥中發(fā)揮作用，NSUN2是m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，但它在肝癌中的臨床意義、作用機(jī)制等尚不明確。
 

　　研究方法：
 

　　臨床樣本采集與分組：收集125對(duì)肝癌(HCC)及相應(yīng)癌旁組織(ANL)，用于RT-qPCR、western blot及IHC分析NSUN2表達(dá)分布與患者臨床特征的相關(guān)性，并進(jìn)行mRNA m5C斑點(diǎn)印跡和m5C-RIP-seq測(cè)序。
 

　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：主要檢測(cè)多株肝癌細(xì)胞株的及增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞行為學(xué)改變。
 

　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用5周齡雄性BALB/c裸鼠，在其雙側(cè)腋窩皮下接種HCC細(xì)胞建立皮下異種移植模型，定期測(cè)量腫瘤體積；通過(guò)尾靜脈注射HCC細(xì)胞建立肺轉(zhuǎn)移模型，用活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移過(guò)程。
 

　　其他：RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、放線菌suD實(shí)驗(yàn)、代謝測(cè)量實(shí)驗(yàn)等；
 

　　主要研究結(jié)果：
 

　　(1)NSUN2在HCC組織中的表達(dá)上調(diào)；
 

　　通過(guò)對(duì)125對(duì)HCC和癌旁組織(ANL)的研究，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)和免疫組化(IHC)分析，結(jié)果顯示HCC組織中NSUN2的蛋白水平顯著高于ANL組織。Kaplan-Meier 生存分析，結(jié)果顯示NSUN2高表達(dá)患者的總生存期(OS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(RFS)明顯低于NSUN2低表達(dá)患者。此外，對(duì)80例HCC患者的臨床病理特征與NSUN2表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NSUN2高表達(dá)與腫瘤大小、微血管侵犯(MVI)、TNM分期和BCLC分期顯著相關(guān)。腫瘤越大、存在微血管侵犯、TNM分期和BCLC分期越晚，NSUN2的表達(dá)越高。
 

圖1. HCC組織中NSUN2高表達(dá)并與HCC不良預(yù)后有關(guān)。
 

　　(2)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NSUN2 對(duì)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響
 

　　運(yùn)用慢病毒分別在HepG2和SNU387細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)NSUN2，在Hep3B和Huh7細(xì)胞中穩(wěn)定沉默NSUN2。過(guò)表達(dá)NSUN2能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移，而沉默NSUN2則抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NSUN2過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)并增加肝癌肺轉(zhuǎn)移，而NSUN2沉默則抑制皮下瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。
 

圖2. NSUN2在體內(nèi)外誘導(dǎo)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
 

　　(3)NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在肝癌HCC中的作用
 

　　對(duì)5對(duì)HCC和癌旁正常肝組織進(jìn)行m5C dot blotting，結(jié)果顯示HCC組織中總mRNA m5C 水平高于ANL組織；m5C-RIP-seq分析顯示HCC和癌旁正常肝組織m5C修飾存在差異，聯(lián)合分析mRNA m5C-RIP-seq和 mRNA-Seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)HCC中mRNA表達(dá)與m5C水平呈輕度正相關(guān)；KEGG通路分析顯示，表達(dá)和m5C水平均上調(diào)的mRNA主要富集在10條信號(hào)通路中，其中癌癥中的中心碳代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝等與代謝相關(guān)。
 

圖3. NSUN2介導(dǎo)的m5C高甲基化促進(jìn)肝細(xì)胞癌的代謝轉(zhuǎn)變。
 

　　(4)PKM2是NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾的主要靶標(biāo)
 

　　對(duì)Hep3B-NSUN2-sh2細(xì)胞及其陰性對(duì)照進(jìn)行mRNA測(cè)序，結(jié)果顯示敲低NSUN2后，236個(gè)基因上調(diào)，376個(gè)基因下調(diào)。將HCC中表達(dá)上調(diào)的mRNA、m5C 水平上調(diào)的mRNA以及 Hep3B細(xì)胞中敲低NSUN2后表達(dá)下調(diào)的mRNA進(jìn)行重疊分析，通過(guò)維恩圖篩選出11個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的mRNA(B3GNT3、CD7、EML2、FOXC1、GDF15、LRP4、MAPT、MCTP1、PKM2、PODXL 和 SLC1A7)。檢測(cè)這11個(gè)mRNA在40對(duì)HCC和癌旁正常肝組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)在HCC中上調(diào)。進(jìn)一步檢測(cè)這7個(gè)mRNA在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在HepG2和SNU387細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NSUN2后，只有PKM2的表達(dá)上調(diào)；在Hep3B 和Huh7細(xì)胞中沉默NSUN2后，PKM2的表達(dá)下調(diào)。此外，根據(jù)m5C-RIP-seq結(jié)果，PKM2 mRNA上調(diào)的m5C峰位于其3′ - UTR(chr15:72491753 - 72491855，hg19)。通過(guò)針對(duì)該峰的m5C-RIP-qPCR驗(yàn)證了這一結(jié)果，進(jìn)一步表明PKM2 mRNA是NSUN2作用的主要靶標(biāo)。
 

圖4. PKM2 mRNA是NSUN2作用的靶標(biāo)。
 

　　(5)NSUN2通過(guò)增加m5C水平穩(wěn)定PKM2 mRNA
 

　　通過(guò)放線菌suD處理HCC細(xì)胞，并在不同時(shí)間點(diǎn)利用RT-qPCR分析PKM2 mRNA水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NSUN2會(huì)減緩PKM2 mRNA的降解，而沉默NSUN2則加速其降解。m5C-RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)SNU387細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NSUN2后，PKM2 mRNA m5C水平升高；在 Hep3B細(xì)胞中沉默NSUN2后，其m5C水平降低；隨后，使用針對(duì)PKM2的m5C峰的引物和經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板進(jìn)行亞硫酸氫鹽PCR，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在chr15:72491773(hg19)位點(diǎn)(C773)的信號(hào)中，既有胞嘧啶(‘C’)又有胸腺嘧啶(‘T’)，這表明該位點(diǎn)在HCC組織和細(xì)胞系中均發(fā)生了m5C 甲基化。通過(guò)計(jì)算各樣本中C773位點(diǎn)的m5C水平，發(fā)現(xiàn)HCC組織中的m5C水平高于癌旁正常肝組織。同時(shí)，SNU387細(xì)胞過(guò)表達(dá) NSUN2后該位點(diǎn)m5C水平上升，Hep3B細(xì)胞沉默NSUN2后該位點(diǎn)m5C水平則下降。最后，構(gòu)建含有野生型3′-UTR的PKM2 mRNA(PKM2-WT)和突變型 C773(PKM2-Mut)的質(zhì)粒進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)NSUN2可增加 PKM2-WT的熒光素酶活性，對(duì)PKM2-Mut則無(wú)此作用；沉默NSUN2的效果則相反表明 NSUN2 對(duì)PKM2的調(diào)控作用依賴于m5C位點(diǎn)C773。
 

圖5. NSUN2通過(guò)增加m5C水平穩(wěn)定PKM2 mRNA。
 

　　(6)NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC的糖酵解和進(jìn)展
 

　　通過(guò)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲低NSUN2后HCC細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成、細(xì)胞外酸化率(ECAR)和糖酵解質(zhì)子外流率(glycoPER)來(lái)評(píng)估糖代謝變化。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)NSUN2顯著增加了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，敲低NSUN2則降低了這些指標(biāo)，表明 NSUN2 促進(jìn)HCC細(xì)胞的糖酵解。
 

圖6. NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC的糖酵解和進(jìn)展。
 

　　隨后，使用siRNA靶向PKM2，發(fā)現(xiàn)其可下調(diào)PKM2四聚體、二聚體和單體的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)NSUN2可減緩這種下調(diào)作用。敲低PKM2抑制了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECAR和glycoPER，而過(guò)表達(dá)NSUN2可部分阻斷這些抑制作用，表明NSUN2 對(duì)HCC糖酵解的促進(jìn)作用部分通過(guò)上調(diào)PKM2實(shí)現(xiàn)。最后，檢測(cè)了PKM2對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響及NSUN2的作用，發(fā)現(xiàn)敲低PKM2抑制了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，而過(guò)表達(dá)NSUN2可阻斷這種抑制作用，說(shuō)明NSUN2通過(guò)上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。
 

　　(7)研究示意圖
 

　　直觀地展示從NSUN2表達(dá)上調(diào)，到PKM2 mRNA穩(wěn)定、PKM2蛋白增加，再到促進(jìn)HCC糖酵解、細(xì)胞增殖和遷移的一系列過(guò)程，為理解HCC的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)，也為后續(xù)研究潛在的治療靶點(diǎn)提供了方向。
 

圖7. NSUN2介導(dǎo)PKM2在HCC中的m5C調(diào)節(jié)機(jī)制示意圖。
 

　　研究總結(jié)：
 

　　肝癌中NSUN2表達(dá)上調(diào)且與預(yù)后不良相關(guān)；NSUN2通過(guò)增加PKM2 mRNA的m5C修飾穩(wěn)定其表達(dá)，促進(jìn)糖酵解，進(jìn)而推動(dòng)肝癌進(jìn)展，研究明確PKM2是NSUN2介導(dǎo)m5C修飾的靶基因，揭示NSUN2促進(jìn)肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。綜合多種實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞、動(dòng)物模型及臨床樣本驗(yàn)證，NSUN2可作肝癌預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，為肝癌臨床診療提供新思路。
 

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