免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)實驗

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)實驗流程：

• 樣品準(zhǔn)備

將不同分組的細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出（每組2個10cm的皿），在冰上用預(yù)冷的PBS洗一遍，加入裂解液（20mM Tris-HCL Ph7.5、150 mM Nacl、1%TritonX-100、1 mM EDTA和蛋白酶抑制劑），用細(xì)胞刮裂解細(xì)胞。13000rpm 4℃離心10min，去上清進行蛋白定量。定量后原液備用。

• 蛋白定量

1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一塊酶標(biāo)板，按照下表加入試劑

2. 根據(jù)樣品數(shù)量，將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配制適量BCA工作液，充分混勻；

3. 各孔加入160μl BCA工作液；

4. 把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度。以吸光值為橫坐標(biāo)，蛋白濃度（μg/μl）為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；

5. 在酶標(biāo)板中加入2μl待測蛋白和18μl PBS（稀釋10倍），加入160μl BCA工作液，把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度。

6. 根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白濃度（μg/μl），乘以樣品稀釋倍數(shù)（10）即為樣品實際濃度（單位：μg /μl）。

• 共沉淀

• 根據(jù)蛋白定量結(jié)果，將各組蛋白留取適量用于做input對照；

• 分別取各組細(xì)胞蛋白置于2個1.5ml離心管中（2mg每管），其中一個加入2ug IgG，另外一個加入2ug IP指標(biāo)對應(yīng)的抗體，冰上孵育2h；

• 分別向兩個管子中加入protein G-Agarose beads（Roche），加裂解液至1ml。4℃旋轉(zhuǎn)混勻，孵育過夜；

• 2500rpm，4℃離心1min，去上清，1ml裂解液洗滌沉淀4次；

• 加入2×蛋白上樣緩沖液，輕輕混勻后煮沸5min，2500rpm離心1min，棄沉淀；

• 將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用于western blot檢測相應(yīng)蛋白。

• PAGE膠的制備

1. 下層分離膠的制備

根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度，高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。 GRα 90kDa  AP-1  43.48kDa   IkB  39kDa  STAT3 79， 86kDa  NF-KB p65   故選用10%的膠。不同濃度的分離膠按下表進行配制，待下層膠凝固后進行上次濃縮膠的配制。

2. 上層濃縮膠的配制

根據(jù)需要按下表配制濃縮膠，并插好梳子。

• 上樣及電泳

1. 上樣

每孔上樣量約為20ul蛋白，可以根據(jù)實驗要求加大上樣量。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，取下梳子用槍輕輕吹打加樣孔，避免孔內(nèi)有余膠殘留影響上樣。將準(zhǔn)備好的樣品用加樣槍慢慢加到對應(yīng)的孔內(nèi)，注意勿溢出加樣孔。

2. 電泳

一般濃縮膠80V 20分鐘，分離膠120V 60分鐘，可以根據(jù)具體實驗要求調(diào)整電壓和時間。當(dāng)染料到達(dá)膠底部時切斷電源，停止電泳，進行下一步轉(zhuǎn)膜。

• 轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜分為濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)，本實驗室選用半干轉(zhuǎn)。

半干式轉(zhuǎn)膜中，三明治的排列為：/慮紙/膠/膜/慮紙，用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕后，直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間。膠于負(fù)極而膜置于正極。半干式的電轉(zhuǎn)緩沖液不同于濕式的電轉(zhuǎn)緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V轉(zhuǎn)膜30分鐘即可。轉(zhuǎn)膜前將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分鐘（NC膜在電轉(zhuǎn)液中浸泡10-20分鐘），再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5 分鐘，膠也需在冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡3-5 分鐘，否則轉(zhuǎn)膜時會導(dǎo)致條帶變形。

• 膜上蛋白的檢測

為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可用麗春紅染色，麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10 稀釋，即加9 倍的ddH₂O

染色方法：將膜放入TBST 洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下?lián)u動染色5 分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST 或水重新洗后再進行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進行封閉。

• 膜的封閉及抗體孵育

1. 封閉：5%脫脂奶粉（檢測磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1小時或4℃過夜。

2. 一抗：根據(jù)說明書GRα 1:800  AP-1  1:1000   IkB  1:1000  STAT3 1:1000  NF-KB  1：1000  稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2小時或4 ℃孵育過夜。

3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5min。隨后根據(jù)用量，按照1:1000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1h。用TBST洗滌3次，每次5min。

• 顯色

ECL化學(xué)發(fā)光檢測：配制ECL發(fā)光液，根據(jù)用量，取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5分鐘。倒掉顯色液，用紙小心吸取顯色液，在上面蓋上一層平整的透明紙。將其放入成像系統(tǒng)中進行掃描?？梢愿鶕?jù)條帶強弱再次感光或減短感光時間已達(dá)到理想結(jié)果。